标题：用高倍显微镜观察叶绿体和线粒体

 

一、        叶绿体的观察

（一）目的：

     使用高倍显微镜观察叶绿体的形态与分布

（二）实验前的思考

     叶肉细胞中的叶绿体，呈绿色，扁平的椭圆形或球形。叶绿体高等植物（如葫芦藓）的叶绿体呈椭球状，在不同的光照条件下，叶绿体可以运动，改变椭球体的方向，这样既能接受较多的光照，又不至于被强光灼伤。在强光下，叶绿体以其椭球体的侧面朝向光源，在弱光下，叶绿体以其椭球体的正面朝向光源。因此，在不同光照条件下采集的葫芦藓,其小叶内叶绿体椭球体的形状不完全一样

（三）实验材料与试剂

1、材料：水王荪（黑藻），（葫芦藓或墙藓或菠菜叶）

2、器材：显微镜、载玻片、盖玻片、镊子，滴管

 

（四）实验步骤：

制作临时装片：        洁净玻片     滴清水   镊取一片黑藻叶     加盖玻片

观察叶绿体：            先低倍镜后高倍镜观察叶绿体的形态与分布

观察细胞质的流动：          

 

（五）参考资料：

1、加速细胞质的流动方法

①  进行光照,即在阳光或灯光下放置15～20 min；

②  提高盛放黑藻的水温,可加入热水将水温调至25 ℃左右；

③        切伤一小部分叶片。

2、观察细胞质流动的代替实验材料　观察细胞质流动的材料,如果找不到黑藻,可用以下材料代替:

　　①紫鸭跖草雄蕊的花丝表皮毛；

　　②鸭跖草的蓝色花瓣,观察韧皮部筛管细胞中的细胞质流动；

　　③向日葵舌状花花冠的表皮；

　　④万寿菊管状花的花瓣表皮；

　　⑤新鲜大白菜内层叶片宽大中脉处的表皮；

　　⑥黄瓜嫩茎的表皮毛；

　　⑦小麦的根毛。

 

 

二、线粒体的观察
（一）目的

认识最重要的细胞器之一线粒体的基本形态和分布，学会在光学显微镜下观察线粒体的技能。

（二）实验前的思考

线粒体是广泛存在于动、植物细胞中的重要细胞器。它呈短棒形，长0.4～3微米，宽0.3～0.8微米，光学显微镜刚好能看清它的轮廓(光学显微镜分辨率在0.2微米)。线粒体是细胞内糖、氨基酸、脂肪酸最终氧化的场所，所以有“动力工厂”之称。利用这个性质，线粒体可使特异性染料詹姆斯绿(Janus green B)保持氧化状态，呈蓝绿色，线粒体周围的细胞质中的詹姆斯绿被还原成无色状态，从而显示线粒体。

　　

（三）实验材料与试剂

1、材料：人的口腔上皮细胞、洋葱内表皮、幼苗或幼根

2、器具：显微镜，载玻片，盖玻片，消毒牙签，吸水纸，镊子；

3、试剂的配制

（1） 0.5g詹姆斯绿溶解于50ml生理盐水中——1%詹姆斯绿染液

（2） 配制0.9%的生理盐水200ml。称取1g詹姆斯绿，溶于50ml生理盐水中，再用生理盐水稀释100倍，得0.02%詹姆斯绿染液装入棕色瓶备用。　　

（3）0.05g 詹姆斯绿溶解于5ml Ringer液。

Ringer液（复合生理盐水）：0.25g kcl+0.85gNacl+0.03gCacl 加入100ml水）

（四）步骤　　

1.观察人口腔上皮细胞线粒体

(1)把清洁的载玻片平放在桌上，滴上数滴詹姆斯绿染液于载玻片中央。

(2)用消毒牙签的钝端在自己口腔颊粘膜处稍用力刮取口腔上皮细胞，均匀地涂到载玻片的染液中。盖上盖玻片，四周溢出的染液用吸水纸吸干。　

(3)5分钟后用高倍镜或油镜观察，可以看到在接近无色的口腔上皮细胞的细胞质中，特别是在细胞核周围，散布着许多被染成蓝绿色的短棒状或颗粒状结构，即为线粒体。

2.观察洋葱鳞茎表皮细胞线粒体

　(1)撕取5×5毫米一块新鲜洋葱鳞茎内表皮，展平在洁净载玻片中央。

　(2)滴上数滴詹姆斯绿染液染色10分钟，盖上盖玻片，用吸水纸吸去周围溢出的染液。

　(3)在高倍镜或油镜下可以观察到细胞质中的线粒体被染成蓝绿色，呈条状或颗粒状。

（五）注意事项

   詹姆斯绿染液浓度不宜过高，染色时间不宜太长，否则细胞质会重新氧化成有色状态而不能充分还原染料成无色状态。

配制时间：詹姆斯绿染液宜在使用时配制新鲜液，不可久存。

（六）分析和讨论

真核细胞内一般都存在线粒体，但存在的数量相差较大。动物细胞中的心肌细胞和肝脏细胞中线粒体数量最多；植物细胞中幼苗和贮藏组织的细胞中线粒体较多。选取植物细胞的材料应该避免组织坚硬、细胞壁厚老及富含叶绿体的材料，宜选黄化幼苗或新鲜、生长势旺的组织。

（七）参与资料

线粒体是一种动态的易变结构。经过处理在光学显微镜下呈现为颗粒状、棒状或弯曲细线。线粒体的形态和数量随不同生物、不同组织及不同生理状态而发生变化，例如肝细胞、胰细胞的线粒体通常呈线状，成熟的卵细胞内线粒体呈颗粒状，肾细胞内的线粒体呈棒状。显示线粒体的方法可以概括为以下几种：

1、 生活细胞的观察。

如将组织培养细胞或其他生活细胞，放在相差显微镜下，就可以看到细胞质内有线状小体活动，这就是线粒体。

2、 活细胞染色法。

就是利用某些无毒或毒性较小的染料，显示出细胞内某些特殊结构存在的真实性，而并不对细胞的活动有影响，如Janus green B（詹纳斯绿B），就是一种毒性较小的碱性染料。将其配制成一定浓度，对活细胞进行染色，在细胞质内可以看到被染成蓝绿色的线状或颗粒小体，这就是线粒体。还可看到其在细胞质内的活动状况。线粒体所以能显示出蓝绿色，是由于线粒体中具有细胞色素氧化酶系统，它是染料始终处于氧化状态呈蓝绿色，而在周围的细胞质中的染料被还原呈无色。

3、 固定染色法（即永久制片法）。

用特殊的固定液染色处理动物的组织或细胞后，可显示出线粒体的形态。但所用材料必须新鲜，否则线粒体常因已经破坏而显示不出，线粒体的组成成分主要是脂蛋白，脂类又以磷脂为主，用于线粒体的固定液含有饿酸，重铬酸钾等。因为两者均能使脂类物质保存下来，故可显示出线粒体的形态。用于显示线粒体形态的固定、染色方法较多，常用的有Altmann染色法、Regand染色法及Chmpy-Kull染色法等，但欲显示线粒体的细微结构，则要用电镜技术。

线粒体的观察

1、取玉米的幼根作徒手切片。

2、切片于固定液（3%重铬酸钾水溶液：4%福尔马林=8：2）固定1小时。

3、3%重铬酸钾浸洗0.5小时。

4、蒸馏水浸洗20分钟，多次换水。

5、4%硫酸铁铵5分钟。

6、0.5%苏木精5分钟。

7、蒸馏水浸洗3分钟

8、2%硫酸铁铵分色至细胞核褪至棕黄色。

9、0.5%氨水浸系至细胞核及线粒体成蓝黑色或灰黑色。

4、 分离提取方法。

在一定的低温条件下，将组织细胞破碎制备成匀浆，用于线粒体组分及其在不同生理状态的分离分析研究。