问题:IC点弱或者没有,但HPV分型阳性点显色正常
分析:由于IC和HPV DNA之间存在竞争,高浓度的HPV DNA可能会对IC点的扩增反应产生竞争性抑制,此现象出现时如 HPV分型点显色正常,则认为分型结果正确。
问题:Biotin(生物素)点不显色
分析:①请确认所使用试剂是否仍在有效期内,并且酶标液及显色液是否按要求使用及储存;② 确定实验操作是否严格按照说明书进行、试剂是否按要求保存使用。
问题:阴性对照显现HPV分型阳性点
分析:①PCR试剂可能被污染,取5 ul PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳分析;②重复进行PCR及杂交试验。
问题:杂交膜有很高的背景
分析:①可能由于封闭不足,使未结合的酶标残留在膜上,确保封闭液完全覆盖整个杂交膜;②可能因为没有完全将未结合的试剂清洗干净,确保在显色过程中杂交膜充分清洗,无剩余残留液体。
问题:封阻液抽不动
分析:①仔细观察封阻液是否有絮状微生物或澄淀,如果有则证明封阻液有发霉迹象,是由于操作中没有使用灭菌枪头而造成的;②重新购买封阻液,同时确保试验中使用已灭菌的移液枪头。
问题:什么时候需要做阳性及阴性对照
① 当一个新的医院,一个新的地方开展试验的时候,或更换试验地点的时候,需要进行阴阳性对照试验;
② 当使用的检测试剂批次改变的时候需要做1次阴阳性对照;
③当杂交结果出现令人疑惑,比如多个样本的杂交结果一样,或者杂交结果出现过多的多重感染,以及杂交试验后出现许多无IC点及阳性杂交点的结果等情况下,需要使用同批试剂进行阴阳性对照试验以验证问题所在。
问题:导流杂交试验中的污染主要会出现在那一步中,应该怎样防范
分析:①污染情况主要由PCR操作中样本DNA的交叉而产生;对于此种情况,应严格按照SOP操作,确保PCR加样的试验器材均为专用,特别是移液枪和枪头;
②杂交结果中出现的比较弱的杂交点不是污染造成,而是杂交温度不符合要求而造成的非特异性点。对于此种情况,应在杂交操作的时候,确保杂交液的45℃条件,以及杂交仪的温度是否符合说明要求的误差范围显示。
问题:HPV杂交结果为阴性,但电泳结果为阳性
分析: ① PCR产物变性操作失败;②导流杂交操作失败;③ 电泳所检测到的HPV DNA不包含在凯普试剂盒所能检测到的21种亚型内,此种情况较少。
问题:杂交后的杂交膜没有形成均一的杂交边缘,而且出现同一次杂交结果互相污染的现象
分析:在放分隔膜的时候没有放好,没有形成每个样本独立的杂交间,所以出现了杂交膜之间的互渗、反渗以及下渗现象;
验证方法:在进行预杂交的时候,首先要将杂交膜上的残留溶液全部抽干净,然后先将杂交液加入不相邻的几个杂交孔中,观察其他几孔杂交膜1~2分钟后,如果杂交膜没有出现润湿或者杂交膜表面出现水珠现象(注意杂交膜边缘),则可以继续试验。
预杂交结束后,开泵将预杂交液完全抽干,然后继续开着泵抽1~2分钟,关泵,等待1~2分钟,再加PCR产物及杂交液,将会减少反渗现象。